Выражения «неслитно, неизменно» в данном определении направлены против евтихианского монофизитства, а «нераздельно, неразлучно» — против несторианства. Однако некоторые Церкви усмотрели в халкидонском догмате шаг назад в сторону несторианства и отказались принять решения Халкидонского Собора. Особенно сильной была оппозиция Собору на окраинах Римской империи — в Египте, Сирии и Армении, а также за пределами империи, в частности в Персии. В Египте и Сирии, наряду с епископами, признавшими Халкидон, образовались группы епископов, не признавших его. В Александрии противников Халкидонского Собора возглавил Тимофей Элур, в Антиохии Петр Гнафевс. Армянская Церковь также не признала Халкидонский Собор и в 506 году официально отвергла его. Так оформился первый великий раскол в истории христианства, сохранившийся до наших дней. В VI веке в Египте образовались две параллельные иерархические ветви, обе во главе с «патриархом Александрийским и всея Африки»: одна признавала Халкидонский Собор, другая его отвергала. В грекоязычной Сирии христианство также разделилось на две ветви, каждую из которых возглавил свой «патриарх Антиохийский и всего Востока». В Армении Церковь сохранила единство, но осталась на антихалкидонских позициях. В настоящий момент дохалкидонское христианство представлено несколькими Церквами на территории Армении, Египта, Эфиопии, Эритреи, Сирии, Ливана, Индии и в рассеянии. Совокупная численность членов этих Церквей — около 50 миллионов человек.
Хотя основная оппозиция Халкидонскому Собору сосредоточилась на окраинах Восточной Римской империи, в самом Константинополе отношение к Собору оставалось неоднозначным. Если императоры Маркиан и Лев I его поддерживали, то Зенон занял более осторожную позицию: пытаясь примирить монофизитов с диофизитами, он в 482 году издал «Энотикон» — общее изложение веры, в котором о Халкидонском Соборе умалчивалось. «Энотикон» был поддержан Константинопольским патриархом Акакием († 488), однако папа Римский Феликс III потребовал от Акакия ясного принятия Халкидонского Собора. Не добившись этого, он в 484 году на Римском Соборе низложил Акакия и отлучил его от Церкви. Так началась первая схизма между Константинополем и Римом, длившаяся 35 лет. Схизма продолжалась при императоре Анастасии I и завершилась в 519 году, при императоре Юстине I , когда Константинопольский патриарх Иоанн и легаты Римского папы Гормизды совместно осудили всех отвергавших Халкидонский Собор. В 525 году Константинополь посетил папа Римский Иоанн I, направленный в столицу империи королем остготов Теодорихом (ок.454—526), который в то время владел Римом.
Важную роль в истории христианской Церкви на Востоке сыграл император Юстиниан I (527–565). Этот выдающийся правитель, в 536 году изгнавший из Рима остготов и в последний раз в истории восстановивший политическое единство Римской империи, стремился также восстановить ее религиозное единство. В 537 году он построил в Константинополе собор Святой Софии — самый величественный храм христианского Востока.
В 40–х годах VI века Юстиниан инициировал пересмотр церковного отношения к ряду богословов, чье наследие оставалось предметом споров. В 542 году император издал эдикт, содержащий 10 анафематизмов против Оригена и последователей его учения. Этот эдикт был рассмотрен и одобрен на церковном Соборе в Константинополе в 543 году. Вместе с Оригеном были осуждены также писатели IV века Дидим Александрийский и Евагрий Понтийский, в чьих сочинениях усмотрели влияние оригенизма.
В 544 году Юстиниан издал новый эдикт, в котором осуждению были подвергнуты Феодор Мопсуестийский, а также возражения Феодорита Кирского (Ок.393–Ок.460) против Кирилла Александрийского и «Письмо к Марию Персу» Ивы Едесского (V век). Этот эдикт состоял из трех глав, и его стали называть эдиктом «о трех главах» (три главы эдикта смешали с тремя епископами, которые в нем осуждались). Эдикт о трех главах был воспринят многими как удар по Халкидонскому Собору, поскольку затрагивал богословов, которые на этом Соборе были оправданы. Лишь под угрозой низложения и ссылки этот эдикт подписали восточные патриархи. Однако императору необходимо было добиться подписи папы Вигилия (537–555), для каковой цели папа был силой доставлен в Константинополь в 547 году. По прибытии в столицу папа сначала категорически отказывался подписываться под императорским эдиктом, однако под давлением василевса вынужден был согласиться. В 551 году Юстиниан издал новый эдикт о трех главах, под которым папа категорически отказался подписываться. Опасаясь за свою жизнь, Вигилий скрылся в храме Святого Петра: там его пытались арестовать, но он отчаянно сопротивлялся. В конце концов папу посадили под домашний арест, где на него продолжали оказывать давление.
