После смерти прямого потомка Медичи власть оказалась в руках Козимо I (1537–1574), дальнего потомка по линии брата Козимо Старшего, Лоренцо. Честолюбивый тиран, Козимо I мечтал стать абсолютным монархом. Для этого ему необходимо было создать из Тосканы единое государство. Используя силу и власть, он с помощью собственного флота завоевал Сиену. Получив титул великого герцога, Козимо I короновался папой Пием V в Риме.
Не являясь потомком Медичи по прямой линии, Козимо I оказывал покровительство и поддержку сохранившимся членам клана Медичи, подчеркивая свою связь со знаменитым семейством. В дополнение к активной внешнеполитической деятельности Козимо I постоянно выступал в роли мецената. Благодаря его денежным средствам был отреставрирован знаменитый университет в Пизе.
Несмотря на дальнее родство, Козимо I страдал подагрой — болезнью, которая мучила многих представителей семейства Медичи. Однако проведенные современные исследования, как ни странно, опровергают причину смерти Козимо от подагры. Ученые обнаружили, что Козимо I страдал тяжелейшей формой артрита, более известной науке под названием «болезнь Форестье».
После смерти Козимо I власть перешла к Франческо Медичи (1541–1587), который уже не обладал ни сильным характером отца, ни его честолюбием. Полностью подчиняясь своей властной и умной жене Бьянке Капелло в вопросах финансов и политики, Франческо оказался верен традициям, заложенным первыми Медичи. Именно благодаря его участию была открыта Академия della Crusca.
В 2007 г. итальянские ученые обнародовали результаты исследований захоронений Медичи, в том числе и захоронения великого герцога Тосканского Франческо I и его жены Бьянки Каппелло. Ранее было принято считать, что смерть супругов произошла одновременно в октябре 1587 г. Перед смертью супруги мучились страшными болями в области кишечника, после их смерти по Флоренции поползли слухи об отравлении. Несмотря на возникшие слухи, официально считалось, что супруги умерли от малярии. Однако проведенные исследования полностью опровергли эту версию.
Известно, что союз Франческо и Бьянки не был одобрен кланом Медичи, что послужило поводом для возникновения конфликта. Дело в том, что Франческо и Бьянка вступали в повторный брак. Свадьбе предшествовала загадочная смерть первых супругов новобрачных, что позволило предположить, что несчастные были отравлены по приказу самого герцога. Одновременная смерть супругов Медичи на вилле близ города Бонисталло вызвала весомые подозрения, связанные с их возможным отравлением. Теперь в роли отравителя выступал наследник престола, кардинал Фердинандо.
Чтобы остановить распространение слухов по Флоренции, Фердинандо приказал провести вскрытие умерших и указать публично точную причину смерти. Придворные медики, выполнив приказание кардинала, в качестве причины смерти, постигшей герцога и герцогиню, указали малярию. Спустя столетия ученым представилась уникальная возможность опровергнуть или подтвердить версию медиков или слухи, распространявшиеся по Флоренции после смерти четы Медичи. Останки Франческо Медичи были захоронены в семейной базилике Сан-Лоренцо. Супруга герцога была захоронена отдельно от него, и место ее захоронения неизвестно. Считается, что ее похоронили в общей могиле, хотя проведенные исследования дают надежду на обнаружение захоронения Бьянки, которое может находиться в семейном склепе, но под вымышленным именем.
Хроники тех лет лишь сообщали, что внутренности усопших были извлечены и подвергнуты процессу бальзамирования. После проведения процедуры бальзамирования внутренности были погребены отдельно. Забальзамированные останки были найдены учеными в церкви Бонисталло спустя два года после вскрытия гробницы Медичи. В подземельях церкви были найдены два глиняных кувшина, в которых находились в почти истлевшем состоянии останки печени, принадлежавшие мужчине и женщине. Размер органов не превышал лесного ореха.
