Новое нападение турок на Родос произошло в 1522 году – весной огромная армия турок под командованием султана Сулеймана Великолепного на четырехстах кораблях высадилась на Родос. 200 000 турок до октября штурмовали крепость, которую защищали триста рыцарей и восемь тысяч пехотинцев. 20 декабря Родос капитулировал на почетных условиях. Турецкая армия при осаде потеряла каждого второго. 180 рыцарей и почти 5 000 родосцев 1 января 1523 года уплыли с Родоса, увезли с собой знамена, пушки, оружие, иконы, мощи, священные сосуды, орденский архив. Император Священной Римской империи Крал V, узнав о турецком нашествии на иоаннитов, сказал: «Ни одна битва не была проиграна так достойно, как битва за Родос». Впоследствии на могиле защитника Родоса великого магистра Вилье де л’Илль – Адама высекли надпись: «Здесь покоится Доблесть – победительница счастья».
24 марта 1530 года император Карл V подписал указ, по которому острова Мальта, Гоццо и Комино, а также стратегический город Триполи на северном побережье Африки передавался Ордену иоаннитов в виде дворянского свободного лена – feudum perpetuum, nobile, liberum, fransum. Лен условно подчинялся вице-королю Сицилии. 25 апреля 1530 года грамоту утвердил римский папа. Верховная власть иоаннитов на Мальте была признана всеми христианскими странами, поддерживавшими с орденом дипломатические отношения.
По договору иоаннитские рыцари должны были охранять от постоянных набегов тунисских пиратов южное побережье Франции и Италии. Орден стал именовать себя «сувереном Мальты». Великий магистр на Мальте имел титул: «Преимущественное Величество». Он являлся правящим государем, ему подчинялись все восемь «языков» – наций. Язык ордена составляли кавалеры Большого Креста, командоры и простые рыцари одного государства, образовывавшие великое приорство того же государства. Каждое приорство было разделено на бальи, или судебные округа, также состоящие из командорств. Судьи – бальи делились на бальи капитулярные, монастырские и по милости. В каждом орденском приорстве была своя казна, деньги в которую собирались в сборных пунктах, располагавшихся на торговых путях, и направлялись в резиденцию ордена.
Флот иоаннитов три раза в год выходил в крейсерское плавание в открытое море из Большой Мальтийской гавани, обычно закрытой железной цепью. Борьба рыцарей с пиратами принесла рыцарскому флоту европейскую славу. Рыцари освобождали тысячи христианских пленников, захватывали сотни пушек и галер. В 1547 и 1551 годах турецкий десант пытался высадиться на Мальте, но был сброшен в море. У входа в гавань Мальты рыцари выстроили форты Сент-Эльмо и Сан-Анжело, форт Сан-Микаэль. Триполи большая турецкая армия все-таки взяла, и его отбить не удалось.
В августе 1557 года великим магистром ордена иоаннитов стал гасконец Жан Паризо де ла Валетт, в тридцатилетнем возрасте участвовавший в защите Родоса от армии турецкого султана Сулеймана.
18 мая 1565 года тридцатитысячная турецкая армия, состоявшая только из янычар, под командованием сераскера Мустафы-паши, штурмовавшего Родос в 1522 году, высадилась на Мальте. У великого магистра было 600 орденских рыцарей и 7 000 солдат. Чуть позже из Сицилии удалось перебросить на Мальту около пятидесяти рыцарей и тысячу испанских аркебузиров.
Форт Сет-Эльмо защищали 120 рыцарей и рота испанцев – турецкий штурм Мальты начался с него. За месяц боев, в которых погиб почти весь гарнизон, сократив янычар на 10 000.
15 июля 1565 года ожесточенный штурм выдержала Бирга. Тысяча янычар на десяти кораблях попробовала обойти Биргу через южную сторону форта Сан-Анжело, но попала под убийственный огонь засадной батареи, первый же залп которой отправил на дно девять судов и восемьсот янычар.
До 7 августа продолжался непрерывный обстрел крепости Бирги, и штурм, произошедший в этот день, закончился бы её взятием, если бы отряд, направленный Ла Валеттом, не разгромил лагерь турок, которые вернулись его отбивать. 18 августа еще один турецкий штурм был отбит благодаря изумительному мужеству отчаянно рубившихся рыцарей по главе с раненым Ла Валеттом.
