Перспективы отбора - страница 9
Для этого были изготовлены плазмиды с геном phoQ, в котором триплеты нуклеотидов, кодирующие аминокислоты белок-белкового интерфейса AVST, были полностью рандомизированы, то есть заменены на случайные тройки нуклеотидов. Затем эти плазмиды вставили в клетки E. coli, из которых их собственный ген phoQ был заблаговременно удален. Кроме того, в геном подопытного штамма вставили ген желтого флуоресцирующего белка под управлением такой регуляторной последовательности, которая обеспечивает активацию этого гена в присутствии активной формы белка PhoP (чтобы клетки, в которых система PhoQ-PhoP сработала, можно было отличить по флуоресценции). В итоге получилась разношерстная популяция кишечных палочек, у каждой из которых в белке PhoQ на месте четырех аминокислот AVST находилась какая-то из 160 000 возможных аминокислотных комбинаций.
Теперь нужно было выбрать из этой популяции те клетки, у которых система PhoQ-PhoP по-прежнему исправно работала. Отбор проводился в два этапа. Сначала микробов выращивали при разных концентрациях ионов магния и отбирали тех, у которых интенсивность желтого свечения соответствовала таковой у контрольных бактерий с последовательностью AVST. Затем отобранных микробов помещали в среду, не содержащую ионов магния. Пережить такое «магниевое голодание» способны только бактерии с исправно работающей системой PhoQ-PhoP.
Геномы бактерий, выдержавших эти испытания, подвергли секвенированию, чтобы получить полный список аминокислотных последовательностей, обеспечивающих нормальную работу системы PhoQ-PhoP. Таких последовательностей оказалось неожиданно много: целых 1659. Ученые выборочно проверили некоторые из мутантных штаммов на способность конкурировать с контрольными кишечными палочками при разных концентрациях ионов магния. Эти эксперименты показали, что приспособленность мутантов осталась на том же уровне, что и у исходного штамма. Таким образом, по крайней мере некоторые (а скорее всего, большинство) из выявленных 1659 последовательностей не имеют серьезных дефектов по сравнению с исходной последовательностью AVST.
Это один из главных результатов работы. Он показывает, что «плато» ландшафта приспособленности, соответствующее функциональному белок-белковому интерфейсу, весьма обширно: оно занимает более 1 % всего пространства последовательностей (1659 точек из 160 000). Это значит, что, подобно генетическому коду, в котором 20 аминокислот и знак «стоп» кодируются 64 триплетами, «белок-белковый» код, обеспечивающий узнавание белками друг друга, тоже обладает высокой избыточностью. Есть много разных вариантов, способных работать одинаково, что, по идее, должно облегчать эволюцию белков. Чем обширнее плато ландшафта приспособленности, соответствующее данной функции, тем больше шансов, что с какой-нибудь его точки удастся перейти (или перепрыгнуть) на другое плато. Иными словами, повышается вероятность смены функции белка в ходе эволюции.
Полученные данные позволили изучить топографию плато и оценить его «эволюционную проходимость» (илл. i на цветной вклейке). Принципиальный вопрос, от ответа на который зависит ход эволюции, а конкретнее динамика перемещения эволюционирующей молекулы по ландшафту приспособленности, состоит в том, насколько сильно влияние четырех аминокислотных позиций друг на друга. Это влияние называется эпистазом. Если эпистаз отсутствует, то плато ландшафта приспособленности, соответствующее данной функции белка, представляет собой ровную, плоскую поверхность, по которой эволюционирующий белок может гулять абсолютно свободно. Есть некий набор «разрешенных» аминокислотных замен, и приобретать их можно в любом порядке. При сильном эпистазе плато становится похоже на лабиринт узких тропинок, разделенных пропастями. По такому плато передвигаться трудно, потому что аминокислотные замены, безвредные в одних контекстах, оказываются вредными в других. В результате порядок приобретения замен становится крайне важным: к каждой точке пространства последовательностей можно теперь добраться лишь строго определенными немногочисленными маршрутами. В таком случае многие работоспособные последовательности, скорее всего, до сих пор не найдены эволюцией просто потому, что у нее не хватило на это времени.
