При Стефане Батории из городовых казаков было выделено 6.000 человек под именем реестровых казаков, которые получали жалование, остальные же должны были быть обращены в поспольство. Реформа Стефана Батория вызвала сильный рост вольных, так называемых «воровских» казаков. Наиболее безопасным пристанищем для них служили острова на Днепре за порогами (в пределах Екатеринославской губ.), где они вскоре организовали своеобразную общину, местопребывание которой называлось Сечью (сечь, сечь соответствует русской засеке, лесной вырубке). Ради безопасности местопребывание общины менялось, так что за все время существования запорожского казачества известно 8 сечей. Наибольшею известностью пользовалась сечь на острове Хортице (Екатеринославской губ.), на месте, где в половине XVI в. была построена каневским старостой Дмитрием Вишневецким крепость для защиты казацких «уходов» на Днепре возле порогов. Община называлась кошем (стан). Она была организована на началах широкого самоуправления; доступ в нее был свободен для всякого под условием только принадлежности к православной церкви. Кроме этого, вступающие в общину должны были расставаться с женами, так как в сечь женщины не допускались.
Во главе войска стояли выборные: кошевой атаман с помощниками – войсковым судьею, писарем и есаулом. Кошевой пользовался неограниченною властью, во время войны, в мирное же время верховная власть принадлежала раде из всех членов общины без ограничения. Со времени своего возникновения запорожское казачество стало во главе почти всех казацких восстаний, которые с этих пор почти не прекращались. Уже в 1590 г. сейм, недовольный их самовольством, издал «порядок со стороны Низу и Украины», содержащий ряд суровых ограничений казацких вольностей. Стефан Баторий запретил выдавать казакам селитру и порох. На эти постановления казаки отвечали восстаниями. Восстания были тем успешнее, что находили для себя хорошую почву среди закрепощаемого поспольства, охотно примыкавшего к казакам, так что волнения принимали характер настоящих крестьянских войн. В конце XVI века вспыхнули одно за другим восстания, во главе которых стояли Косинский, Наливайка, Лобода, Метла Гедройц. Значительных успехов достигли казаки в начале XVII в., когда во главе их стал Конашевич-Сагайдачный. Пользуясь стесненным положением Польши, обратившейся к казакам за помощью для войны с Россией (смутный период), Сагайдачный добился ряда уступок, довел число казаков до 50.000 и первый получил титул гетмана. По его просьбе иерусалимский патриарх восстановил в Украине православную церковь в том виде, в котором она была до унии. Кроме того, Сагайдачный сделал попытку внутренней реформы казачества в демократическом духе, так как в это время уже начинал выделяться верхний слой – старшина. После Сагайдачного восстания не прекращались. Вследствие неудачи казаков, по условиям Куруковского договора, число реестровых казаков было сокращено до 6.000, хотя им был оставлен выборный гетман и свой суд.
Затем следовал ряд восстаний с переменным успехом – Тараса Трясила, запорожского гетмана Павлюга, Остряницы, Дмитрия Гуни. В 30-х и 40-х годах XVII ст. полякам, по-видимому, удалось сломить казаков. Казацкие старшие назначались польским правительством, поляки упрочились и на Запорожье в построенной французским инженером Бопланом крепости Кодак. Вместе с тем панская колонизация, влекшая за собой закрепощение народа, приняла необыкновенные размеры. Народ массами бежал в московские пределы и пробирался на Дон; таким образом на пространстве между Сеймом, Донцом и Доном (Курская, Воронежская и отчасти Харьковская губ.) малорусская вольная казачья колонизация из Польши слилась с великорусской вольной казачьей колонизацией из Московии.
В то время как польское правительство старалось вслед за казаками подвигаться на степь с северо-запада, Москва, как единоплеменная казачьему населению, с еще большим успехом смыкала вслед за донскими казаками и воздвигала свои оборонительные черты укреплений с севера. Систематическая колонизация степей русским правительством началась с XVI века. Московское правительство обыкновенно поселяло на южной границе государства полки, стоянки которых постепенно смыкались валами и засеками. За пределами этих укрепленных линий в степи разъезжали сторожа и станичники, обязанность которых была следить за движением татар и заблаговременно предупреждать население об опасности. Местами в степи устраивались засады, острожки, укрепления, особенно близ татарских дорог – шляхов (сакм), перевозов и перелазов (бродов). Муравский шлях, или Царева дорога, по которой ходил крымский хан, направлялся, как известно, от Крымского Перекопа к Туле водоразделом рек Днепровского и Донского бассейнов. Узкое место, окруженное болотами и лесами между Можью (приток Сев. Донца) и Коломаком (приток Ворсклы) в нашей области было весьма удобно для устройства засады, чем и пользовалось правительство, содержа здесь постоянную стражу. От Муравского шляха у верховье Орели отделялась к востоку Изюмская сакма. Далее она шла от Донца, через который была переправа ниже нынешнего Изюма, а затем водоразделом между Осколом и Донцом, переходя в соседнюю Центральную черноземную область. Наконец третья – Калмиусская сакма – направлялась по нашей области от Молочных Вод к притоку Донца Боровой, где был перевоз, а затем продолжалась в Центральную черноземную область на Дивны. Кроме этих трех главных дорог по нашей области частью или целиком пролегали второстепенные дороги, Бакаев, Ромодановский, Сагайдачный щляхи, направление которых одинаково – от Днепра в центральные местности России.
