Республиканцы называли И-16 «моска». Дело тут, вероятно, отнюдь не в гипотетическом сходстве самолета с мошкой. На ящиках, в которых прибывали в Испанию самолеты крупными буквами было написано «МОСКВА». «МОСКВА» превратилось в «МОСКу».
Боевое крещение истребителя И-16 пришлось на период Гражданской войны в Испании 1936–1939 г.г. Первые самолеты данного типа доставили из Советского Союза на Пиренеи в октябре 1936 г. Вместе с партией из 31 истребителя И-16 тип 5 прибыли летчики 1-й бригады из Брянска. Тремя эскадрильями командовал капитан Тархов.
Уже первое появление 9 ноября 1936 г. истребителей И-16 в небе Мадрида радикально изменило характер воздушной войны. Фактически И-16 стал первым в мире истребителем, способным перевести воздушный бой в вертикальную плоскость, уйти от «карусели» на виражах. Главными противниками истребителей советской конструкции являлись итальянские Фиат CR-32 и германские Хейнкель Не-51. Летчики этих самолетов быстро осознали угрозу, исходившую от И-16, и старались принимать с ними в бой, только имея на своей стороне численное превосходство. У республиканцев самолеты И-16 получили прозвище «Моска» (мошка), сторонники Франко прозвали самолет «Боинг» (за внешнее сходство с американским истребителем) и «Рата» (крыса».
Вторая партия, состоявшая также из 31 самолета, прибыла в Испанию 7 мая 1937 г., 21 мая на Пиренеи доставили еще 17 одноместных И-16 и четыре двухместных И-16УТИ. Самолеты сопровождали летчики, большая часть которых служила в 142-й авиационной бригаде, базировавшейся в Бобруйске. Вместе с советскими летчиками прибыла и небольшая группа испанских пилотов, прошедших курс обучения в Кировобадском авиационном училище. К этому времени в небе Испании с самолетами И-16 произошло несколько катастроф, причиной которых послужила недостаточная прочность узлов навески элеронов. При маневрировании с большими перегрузками в ходе воздушного боя, крепления элеронов разрушались, элероны отрывались и самолет терял управляемость. Инциденты отозвались репрессиями в Советском Союзе. В духе того времени начался поиск виновных в саботаже «врагов народа». Впрочем, настоящую причину отрыва элеронов также установили. В результате была усилена конструкция 150 крыльев, кроме того заменили обшивку элеронов. Четырнадцать истребителей до 1 июля прошли доработку на месте, в Испании, 10 августа 1937 г. в Испанию прибыли 62 самолета, модернизированных в заводских условиях.
Эксплуатация истребителей И-16 в условиях фронта выявила множество других дефектов. Так, колеса основных шасси с пневматиками размерами 750x100 оказались слишком узкими для работы с испанских аэродромов, которые отличались каменистым грунтом. Отскакивающие от колес при взлете и посадки камни повреждали горизонтальное оперение. Дефект устранили путем установки пневматиков размерами 750x150 и дополнительной обшивкой нижних поверхностей стабилизатора и рулей высоты. Источником постоянных проблем стал фонарь кабины. Козырек забрызгивался маслом, поэтому для улучшения обзора летчики старались фиксировать фонарь в открытом положении, однако при маневрировании фонарь самопроизвольно закрывался. Неожиданным плюсом стала чрезмерная задняя центровка самолета. Случаев капотирования почти не отмечалось даже при грубых посадках на неподготовленные площадки.
Много внимания уделялось изучению живучести самолета в условиях реальных боевых действий. Воздушные бои над Валенсией в период с 9 марта по 8 апреля 1937 г. привлекли особое внимание этой проблеме. Выяснилось, что пули крупнокалиберных пулеметов истребителей CR-32 пробивают бронеспинку И-16, защита топливных баков советского истребителя также оставляет желать лучшего.
На рулежке истребителей по полевым испанским аэродромам двигатели М-25 засасывали пыль, из-за чего быстро выходили из строя. Все первые двигатели воздушного охлаждения не оснащались маслорадиаторами, однако опыт эксплуатации И-16 в Испании выявил настоятельную необходимость установки маслорадиаторов. Перегреву двигателей способствовал не только жаркий климат, но и далекое от бережливости отношение летчиков к своим самолетам. Практически весь полет двигатели работали на максимальных оборотах. Никто не предполагал в мирное время, что на самолетах станут пикировать с высоты 3–4 километров до самой земли, так же не предполагали и длительных бреющих полетов. Сорванные струей воздуха на протяжении нескольких километров полевые цветы стали обычным явлением.
