Рабочие чертежи на И-153 были готовы в мае 1938 г., в августе конструкторы закончили документацию для производства головной серии. В том же месяце построили и подготовили к полетам первый опытный И-153 № 5001 с двигателем М-25В. В ходе проведения летных испытаний, закончившихся в октябре, определились некоторые дефекты самолета: недостаточная жесткость крыльев, вибрация элеронов, тряска хвостового оперения. Недостатки были учтены на втором опытном И-153, дублере с заводским № 6005. На этом, более тщательно изготовленном экземпляре, с рулей высоты сняли флеттнер (сервокомпенсатор), сами рули уменьшили по площади (на 0,107%) и увеличили их осевую компенсацию (с 16,5% до 18%). Для устранения вибрации увеличили жесткость элеронов, а их весовую компенсацию довели до 25%. Изменения коснулись и винтомоторной группы: удлинили мотораму, поставили новые замки капота, протестированный бензобак. В стойках шасси шлицевое соединение заменили на двузвенники, использовали диски колес из сплава «электрон» и новый амортизатор костыля.
Осенью 1938 г. постановлением правительства на заводе № 1 организовали единое конструкторское бюро (взамен четырех ранее существовавших) по внедрению И-153 в серийное производство. Начальником этого КБ был назначен М.Н. Тетивкин, ранее занимавшийся внедрением в серию И-15бис.
Зимой вторую опытную «Чайку» отправили в 60-ю авиабригаду Закавказского военного округа, дислоцировавшуюся в районе г. Баку. В начале 1939 г. к полетам на И-153 № 6005 приступил испытатель НИИ ВВС Павел Федрови. Было решено, что это будут одновременно и войсковые испытания, к которым подключатся самолеты из войсковой серии. На первой тестируемой машине № 6005 выполнили 454 полета. Удалось достигнуть максимальной скорости 424 км/ч на высоте 3500 м, практического потолка – 8700 м, добиться набора высоты 5000 м за 6,4 мин, а выполнения виража за 11-12 с. Эти результаты оценивались как промежуточные, считалось, что более высокие показатели можно получить на доработанных самолетах с двигателями М-62.
Между тем, летчики по-прежнему отмечали тряску оперения и вибрацию элеронов, высказывали замечания по шасси и вооружению. 11 апреля 1939 г. И-153 № 6008 из войсковой серии разрушился в воздухе, достигнув на пикировании скорости 500 км/ч. Причиной разрушения определили недостаточную прочность крыльев, которые решили усилить, и с 4-й серии передние кромки зашили фанерой по всему размаху. Чуть позднее передние несущие ленты-расчалки сделали двойными.
В июне 1939 г. начались Госиспытания доработанного истребителя, оснащенного двигателем М-62 со взлетной мощностью 1000 л.с. 16 июня И-153 № 6019 с М-62 и воздушным винтом фиксированного шага (ВФШ) перегнали с завода и в течение 60 дней полностью испытали. Самолет развивал максимальную скорость 443 км/ч на высоте 4600 м, выполнял вираж за 13- 13,5 с, его практический потолок составил 9800 м. В отчете записали, что И-153 М-62 Государственных испытаний не прошел, прежде всего из-за недостаточной максимальной скорости – надеялись получить не менее 460 км/ч (неизвестно, откуда и на каком этапе появилось это число, но еще при подготовке эскизного проекта конструкторы довольно четко рассчитали максимальную скорость 430 км/ч).
Припомнили и другие недостатки, например, недостаточный обзор из кабины пилота, особенно при взлете и рулении. Заказчики требовали установить новый центроплан также типа «чайка», но с улучшенным обзором, хвостовое баллонное колесо. Однако самолет уже строился серийно, поэтому реализовать подобные требования было затруднительно.
Улучшать летные характеристики попытались подбором более эффективных воздушных винтов, установкой винтов изменяемого шага (ВИШ), применением двигателя М-63 с максимальной мощностью 1100 л.с.
Первые два И-153 № 6012 и № 6039, оснащенные двигателями М-63, были готовы осенью 1939 г. Хотя эти самолеты засчитали серийными образцами, заняться их полноценными испытаниями поначалу оказалось нереально, прежде всего из-за недоведенности М-63. Кроме того, машина N2 6012 фактически относилась к разряду опытных – на ней испытывали новый моторный капот с подвижными створками охлаждения типа «юбка». В октябре 1939 г. на этом И-153 летал летчик-испытатель Б. Кудрин. Заметных преимуществ новый капот не дал, и это новшество на «Чайках» не прижилось. Что касается И-153 N2 6039, то на нем занимались отладкой охлаждения двигателя. Так как М-63 имел более напряженный тепловой режим работы, его укомплектовали увеличенным 9-дюймовым маслорадиатором,установленным под капотом двигателя. Несколько изменился и сам капот: были увеличены окна охлаждения в лобовой части, выходную щель на заднем обрезе расширили до 50 мм.
